Sommaire :

Présentation
Principaux Thèmes de Recherche
Collaborations et Partenariats
Conclusion
Sélection de Publication

Présentation

Au sein de l’Institut des Neurosciences de Montpellier (INM), L'équipe est constituée de chercheurs, doctorants et cliniciens unis par un intérêt commun : affiner les stratégies de lutte contre les vertiges d’origine périphérique. En effet, une très large majorité de vertiges (plus de 80%) ont pour origine un dysfonctionnement vestibulaire. On ne dispose aujourd’hui que de peu d’outils efficaces pour lutter contre ces atteintes vestibulaires, pouvant se révéler extrêmement incapacitantes. Ce constat incombe en grande partie à la méconnaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans l’élaboration du message sensoriel vestibulaire.

L'objectif est de caractériser ces mécanismes moléculaires afin d'initier des pistes pour le développement de stratégies thérapeutiques ciblées

Dans ce but, nous avons mis au point différents modèles d’étude (explants, cultures organotypiques et tranches d’organes vestibulaires) et développé des méthodes d’investigation novatrices combinant des techniques de morphologie (immunocytochimie, microscopie électronique), d’imagerie fonctionnelle (microscopie confocale et biphotonique) d’électrophysiologie (patch-clamp, enregistrements intracellulaires, électrodes à sélectivité ionique, potentiels évoqués vestibulaires) et de comportement. Par ces moyens, nous pouvons aujourd’hui analyser les processus d’élaboration et de transfert des informations vestibulaires au cours du développement, chez l’adulte et aussi en conditions pathologiques.

Principaux thèmes de recherche

L’endolymphe est le liquide de l’oreille interne qui baigne la partie apicale des mécanorécepteurs vestibulaires et auditifs. Ce liquide est très riche en K+ constitue le moteur électrochimique de mécanotransduction (codage d’une information mécanique – mouvement de la tête- en message électrique). Son homéostasie ionique est très finement régulée (Fig.1). La perturbation de cette homéostasie est une des possibles origines du syndrome de Menière, seconde cause de vertige chez l’homme et dont le traitement reste extrêmement limité.

L’établissement de stratégies de lutte contre ce type de vertige requiert l’identification des mécanismes des sécrétions ioniques dans l’endolymphe et leurs voies de régulation. Grâce à la mise au point d’un modèle de culture organotypique d’utricule murin, capable de régénérer in vitro le compartiment endolymphatique (Fig.2, Gaboyard et al. 2005), nous pouvons étudier aujourd’hui, au moyen d’électrodes sélectives au potassium (K⁺), la cinétique et les régulations de la sécrétion du K⁺ dans l’endolymphe. La caractérisation pharmacologique des canaux liés aux sécrétions ioniques est en cours chez des souris sauvages et porteuses de mutations pour certains canaux ioniques. Cette approche moléculaire associée à des investigations fonctionnelles intégrées (mesure réflexe occulo-moteur) chez l’animal devrait permettre des avancées importantes vers l’identification des mécanismes cellulaires de sécrétions ionique dans l’endolymphe et de leurs voies de régulation.

Figure 1 : Représentation schématique du compartiment endolymphatique entourant les organes sensoriels vestibulaires. Ce compartiment est délimité par plusieurs types de cellulaires: les cellules sensorielles, les cellules de soutien, les cellules transitionnelles (transitional cells), les cellules sombres (dark cells) et les cellules canalaires (canal/wall cells). Chaque cellule est impliquée dans le contrôle de flux ioniques dont la résultante est l’homéostasie ionique de l’endolymphe. La forte concentration potassique (± 140 mM) est primordiale à l’établissement du message sensoriel vestibulaire.

Figure 2. Culture organotypique d’utricule (organe détecteur des accélérations linéaires – gravité). Dans nos conditions de culture, le compartiment endolymphatique se régénère en quelques jours. Une électrode (A, flèche) traversant la cloison néoformée de cellules canalaires permet de mesurer différents paramètres : potentiel endolymphatique utriculaire (B), concentration en K+ (C), potentiel de repos des cellules sensorielles (E). DIV : jours in vitro ; UP : potentiel endolymphatique de l’utricule, [K+] cyst : concentration potassique endolymphatique ; RMP : potentiel de repos des cellules sensorielles (d’après Gaboyard et al., 2005).

A : Enregistrement direct de l’activité synaptique calicéale
B : Imagerie calcique de la transmission synaptique
C : Bases moléculaires des activités électriques des neurones primaires vestibulaires

Les bases moléculaires des signaux biologiques rapides mis en jeu au niveau des synapses sensori-neurales vestibulaires restent aujourd’hui en grande partie inconnues. Ceci s’explique par leur difficulté d’accès et leur extrême fragilité qui ont jusqu’à présent freiné les caractérisations fonctionnelles. L’innervation des cellules sensorielles par les neurones afférents est constituée de terminaisons en bouton (rencontrées également dans la cochlée) et de terminaisons en calice (une spécificité vestibulaire où l’extrémité dendritique recouvre tout le pôle basolatérale de la cellule sensorielle) infiltrées entre les cellules sensorielles et leurs cellules de soutien, au sein de l’épithélium neurosensoriel. La plupart des synapses sensori-neurales sont glutamatergiques. Elles sont à ce titre, sensibles à l’effet délétère de l’excitotoxicité glutamatergique (rencontré chez l’homme en cas d’ischémies locales). Pour contourner les difficultés d’études, nous avons récemment mis au point trois approches novatrices afin d’explorer les propriétés moléculaires et pharmacologiques des neurones vestibulaires isolés, en culture ou en connexion avec les cellules sensorielles sur explants et tranches d’organes vestibulaires:

A: Enregistrement direct de l'activité synaptique calicéale
Le développement d’enregistrements électrophysiologiques par la technique de patch apposé (loose-patch) sur explant, préservant l’intégrité structurale du terminal en calice, nous permet aujourd’hui d’effectuer la caractérisation pharmacologique des mécanismes cellulaires (récepteurs, canaux ioniques) qui contrôlent la mise en place et la transmission du message sensoriel vestibulaire. Ce type d’approche nous permet d’accéder à l’activité électrique (de repos ou évoquée par stimulation naturelle des cellules sensorielles) des terminaisons post-synaptiques. Activité qui résulte directement de la transmission synaptique calicéale. Ces études pharmacologiques nous ont permis de préciser le rôle respectif des récepteurs de type AMPA et NMDA (tous deux présent au niveau de la synapse en calice) dans la genèse de ces évènements synaptiques (Fig. 3, Bonsacquet et al. 2005)

B: Imagerie calcique de la transmission synaptique
La caractérisation pharmacologique de la neurotransmission au niveau des synapses vestibulaires en bouton (dont la taille empêche les enregistrements électrophysiologiques) a nécessité le développement d’une méthode d’analyse (par imagerie biphotonique) des évènements calciques liés à la neurotransmission sensori-neurale dans un modèle ex vivo intégré préservant l’épithélium vestibulaire et son innervation (Boyer et al. 2004). Des études pharmacologiques sont actuellement développées lors de stimulations présynaptiques (stimulations mécaniques des cellules sensorielles, applications ionophorétiques de K+ ou glutamates, Fig. 4).

 Figure 4 : Imagerie biphotonique des flux calciques dans les terminaisons postsynaptiques en réponse à une stimulation présynaptique. En traitant avec une sonde calcique fluorescente les neurones vestibulaires au niveau d’une section de leurs axones, les terminaisons dendritiques sont chargées avec la sonde calcique grâce à un transport rétrograde (A). Les terminaisons postsynaptiques vivantes sont ensuite visualisables en microscopie biphotonique au sein de la tranche d’organe ou de l’explant vestibulaire (B, têtes de flèche b : boutons postsynaptique ; tête de flèche c : postsynapse en calice). La dépolarisation directe de la présynapse par une application ionophorétique de potassium sur une cellule sensorielle (C) induit une émission fluorescente, par la sonde calcique, reflétant une augmentation de la concentration calcique dans la postsynapse (2 exemples en D). (D'après Boyer et al. 2004)

 
C : Bases moléculaires des activités électriques des neurones primaires vestibulaires.
Les neurones vestibulaires transmettent les informations élaborées par les cellules sensorielles au système nerveux central. Ces neurones possèdent différentes activités électriques selon leur équipement en canaux ioniques. La caractérisation de ces canaux, par la technique de patch-clamp a permis de comprendre leur implication dans la maturation neuronale (Chambard et al. 1999 ; Chabbert et al. 2001a ; Chabbert et al. 2001b,). Nous avons entrepris l’analyse moléculaire des sous-unités associées aux différentes activités électriques par single cell RT-PCR  (Autret et al. 2005). A titre d’illustration, le couplage de ces techniques nous a récemment permis de démontrer que les neurones vestibulaires possèdent un courant calcique de type T associé à l’expression de la protéine Cav3.2. Ce courant apparaît essentiellement au cours de la période de pousse neuritique (Fig. 5, Autret et al. 2005). Son implication directe dans ce processus est en cours de démonstration.

Figure 5 : Expression du courant calcique T Cav3.2 par les neurones vestibulaires lors de la période de neuritogenèse. Les neurones embryonnaires sont dotés d’une conductance calcique de bas seuil (A, enregistrement en patch clamp) de type T Cav3.2 (analyse en « single cell RT-PCR »). Cette conductance est préférentiellement exprimée au cours de la période prénatale correspondant à la pousse neuritique (B). A ce stade, les neurones sont capables de déclencher des potentiels d’action calciques et sodiques (C). En B, n : nombre de neurones analysés ; E14, 15, 17 : 14^e, 15^e, 17^e jour de développement embryonnaire ; P0 : jour de la naissance, P4 : 4^e jours de vie postnatale. (D'après Autret et al. 2005)

A : Mécanismes moléculaires impliqués dans la synaptogenèse
B : Mécanismes moléculaires de la réparation synaptique post-lésionnelle
C : Plasticité des organes sensoriels vestibulaires

Dans le système nerveux central, le calcium, le glutamate et l’activité électrique jouent un rôle crucial dans la plasticité synaptique aussi bien lors de l’établissement des synapses que dans les processus régénératifs suivant des lésions excitotoxiques (ischémie, anoxie). Comme le vestibule est l’une des rares structures périphériques à posséder une innervation glutamatergique, nous nous sommes intéressés aux mécanismes de plasticité liés à sa maturation synaptique et à sa réponse à une atteinte excitotoxique.

A : Mécanismes moléculaires impliqués dans la synoptogenèse.
Pendant le développement embryonnaire, nous avons démontré que les neurones vestibulaires utilisent un courant calcique particulier afin de favoriser la pousse de leur neurites vers les cellules sensorielles (Cf. § précédent). Après la naissance, la synaptogenèse conduit à la mise en place de synapses fonctionnelles entre les cellules sensorielles et les neurones. Une de nos études ontogénétiques a porté sur l’élément présynaptique : les cellules sensorielles. Ces dernières acquièrent une excitabilité transitoire, grâce à l’expression d’une conductance sodique activée par le voltage de type Nav1.2 (caractérisation par patch-clamp et single cell RT-PCR). Cette conductance ionique confère aux cellules sensorielles la capacité de générer des potentiels d’action (Fig. 6, Chabbert et al. 2003a ; Mechaly et al. 2005) et de sécréter de manière activité-dépendante du BDNF, facteur neurotrophique indispensable à l’attraction des terminaisons dendritique et à la stabilisation synaptique. Cette démonstration constitue une avancée dans la compréhension des mécanismes qui contrôlent l’instauration fonctionnelle de l’innervation périphérique vestibulaire.

Figure 6 : Expression du courant sodique Nav1.2 par les cellules sensorielles pendant la période de synaptogenèse. L’enregistrement en patch-clamp d’une cellule sensorielle (A) permet l’obtention d’une courbe « intensité/voltage » (insert en A) d’un courant sodique (B) que l’analyse en single cell RT-PCR associe majoritairement à la sous-unité Nav1.2. L’expression de ce courant par les cellules sensorielles est maximale au cours des premiers jours de vie postnatale (C). Pendant cette période, les cellules sensorielles sont capables de générer des potentiels d’action sodiques (insert en C). (D'après Chabbert et al. 2003a)

B : Mécanismes moléculaires de la réparation synaptique post-lésionnelle.
Chez l’adulte, la capacité des cellules sensorielles à ré-exprimer la conductance sodique immature Nav1.2 (Cf. § précédent) a été étudiée en cas de dénervation. En effet lors d’atteintes ischémiques locales, les contacts synaptiques entre neurones et cellules sensorielles sont détériorés selon le processus d’excitotoxicité glutamatergique. Nous avons reproduit in vivo ce type de lésion par administration locale d’un analogue du glutamate (le kainate) et étudié son impact sur les cellules sensorielles adultes (Fig. 7). L’atteinte des terminaisons synaptiques provoque (i) la réexpression des canaux sodiques activés par le voltage par les cellules sensorielles, (ii) le retour de sa capacité à générer des potentiels d’action (Fig. 7). De plus, après excitotoxicité, les épithélium sensoriels sécrètent de nouveau du BDNF (technique d’ELISA in situ) en réponse à une stimulation électrique. Nous démontrons donc que des atteintes excitotoxiques induisent la ré-acquisition d’une phase d’excitabilité par les cellules sensorielles (Brugeaud et al. 2007). Ces réponses adaptatives à la dénervation participent vraisemblablement à la restauration des synapses. En effet, les lésions excitotoxiques sont transitoires dans le vestibule comme l’atteste le retour à la normale des propriétés électrophysiologiques des cellules sensorielles (Fig.7 B).

Figure 7 : In vivo, une lésion excitotoxique induit la réexpression du courant sodique Nav1.2 par les cellules sensorielles adultes. L’administration de kainate dans l’oreille interne d’un animal adulte provoque des lésions excitotoxiques des dendrites innervant les cellules sensorielles. Les terminaisons en calice (NC en A) et en boutons (B en A) subissent des lésions œdèmateuses transitoires (A, microscopie électronique de cellules sensorielles (HC1) contactées par des calices et des cellules sensorielles (HC2) contactées par des boutons synaptiques). Au cours de ces atteintes synaptiques, les cellules sensorielles réexpriment le courant sodique Nav1.2 (B, K + 48h) alors que les cellules non lésées (B, control P40) en sont dépourvues. La réapparition de ce courant sodique est bien liée à l’excitoxicité puisque l’antagoniste glutamatergique DNQX empêche cette réexpression (B, K + DNQX + 48h). Un retour à l’état normal s’effectue 7 jours après le choc excitotoxique (B, K + 7 days). Pendant cette période, les cellules sensorielles sont capables de déclencher des potentiels d’action sodiques (insert en B). (D'après Brugeaud et al. 2007)

C : Plasticité des organes sensoriels vestibulaires.
La plasticité d’une structure biologique apparait particulièrement au cours du développement et combine des facteurs génétiques et épigénétiques dont les conséquences s’expriment par des processus biochimiques et électriques (voir ci-dessus). Pour appréhender plus avant la plasticité vestibulaire, nous avons modifié un paramètre épigénétique pour rechercher ces éventuelles conséquences morphologiques ou fonctionnelles au niveau de l’épithélium neurosensoriel. En collaboration avec le CNES nous avons mis au point des expériences visant à modifier un stimulus primaire du vestibule : la pesanteur. Une centrifugeuse installée au laboratoire (Fig.8) nous permet de soumettre des rats à des conditions d’hypergravité (2 G) au long de leur développement in utero et postnatal. Des conséquences morphologiques (retard dans l’établissement des contacts synaptiques - Gaboyard et al, 2003, Fig.9) et fonctionnelles (modifications des conductances ioniques activées par le voltage - Chabbert et al. 2003b, Fig 10) ont déjà été démontrées par notre groupe. Le caractère permanent ou réversible de ces modifications est à l’étude.

Figure 8. Centrifugeuse mise à notre disposition par le CNES permettant le maintien de murins en pesanteur modifiée. La rotation à vitesse constante des cages produit un champ gravitaire de 2 G, compatible avec la vie de rates gestantes, la naissance et le développement de leur progéniture.

Figure 9. Immunocytochimique détection de la synaptophysine en normo et hypergravité dans le saccule et l’utricule de rat de 6 jours. Dans les conditions normales, la synatophysine se concentre à l’apex du calice nerveux dans les organes vestibulaires (saccule et utricule, flèches en A et B). En hyper-gravité, l’expression présynaptique de la synaptophysine est similaire à celle de la normo-gravité dans le saccule (C). Par contre dans l’utricule, la synaptophysine apparaît dans la région baso-latérale du calice, une distribution similaire à des stades plus immatures (D, flèches). L’hyper-gravité retarde donc la maturation présynaptique dans l’utricule uniquement, car l’utricule, et non le saccule, est la structure vestibulaire spécialisée dans la détection des variations de gravité. En conséquence, il apparaît que dans le vestibule, la maturation synaptique dépend de facteurs épigénétiques propres à chaque récepteur vestibulaire. (D'après Gaboyard et al. 2003)

Figure 10. Le développement de jeunes rats en hypergravité (2G) induit une augmentation importante des courants ioniques globaux sortants activés par le voltage des cellules sensorielles vestibulaires de l’utricule (organe spécialisé dans la détection de la gravité). Niveau de dépolarisation donné à droite des traces.(D'après Chabbert et al. 2003b)

Conclusion

L’identification des mécanismes moléculaires impliqués dans l’élaboration du message sensoriel vestibulaire et sa transmission vers les centres supérieurs constitue un pré-requis pour la mise en place de stratégies de lutte contre les vertiges. Notre approche, à la fois moléculaire et intégré permet d’entrevoir des applications dans (1) le traitement ciblé de la maladie de Ménière ; (2) la mise au point de vestibuloplégiques efficaces pour soulager les crises de vertige ou le mal des transports ; (3) la détermination des conditions les plus favorables à la survie des neurones vestibulaires dans le cadre de futures greffes de vestibule ou de prothèses vestibulaires. 

Collaborations:

J Goldberg School of Allied Health Sciences East Carolina University Chicago, USA
A Lysakowski Anatomy and Cell Biology, Univ. of Illinois at Chicago, USA
C Holt Department of Otolaryngology University of Texas UTMB Galveston, USA
T Jones School of Allied Health Sciences East Carolina University Greenville, USA
J Barhanin Institut de Pharmacologie du CNRS Sophia Antipolis Valbonne, France
J Llorens Departament de Ciencies Fisiologiques II Universitat de Barcelona, Spain
W Marcotti Department of Biomedical Science University of Sheffield Sheffield, UK
D Marcus University of Manhattan Kansas, USA

Partenariats :

Centre National des Etudes Spatiales (CNES), Laboratoires SERVIER, Laboratoires SOLVAY-PHARMA

Sélection de publications :